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熒光定量PCR實驗中CT值出現(xiàn)異常的原因分析

 更新時間:2022-03-30 點擊量:17722

     熒光定量PCR是生物醫(yī)學(xué)中常用的檢測核酸病毒的方法之一,由此,這幾年PCR 儀也成了近幾年臨床檢測和分子生物學(xué)研究的主要實驗室設(shè)備。 我們知道CT值是PCR 擴增曲線中的重要參數(shù),那么CT值是什么?它與 PCR擴增存在什么關(guān)系?為什么有的時候基因擴增實驗中會出現(xiàn) CT 值異常甚至缺少CT值的情況?

什么是CT值?

     在熒光定量PCR擴增實驗中,當(dāng)擴增產(chǎn)物的熒光信號(Fluorescence signal)達到設(shè)定的熒光閾值(FLUORESCENCE threshold)時的所對應(yīng)的擴增循環(huán)數(shù)(Cycle Threshold)。也可以理解為在qPCR實驗過程中初始模板擴增到一定產(chǎn)物量值時,所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。 CT 值的表達公式為:擴增產(chǎn)物量=起始模板量×( 1+En)循環(huán)個數(shù)。


熒光定量PCR

通常QPCR實驗中CT值的異常主要有以下幾種情況:

 一、擴增曲線正常,CT值偏大或偏小

CT值表達公式中我們可以看出初始模板的質(zhì)量和擴增效率,會直接影響到CT值的大小。 如果擴增起始模板量濃度高或引物設(shè)計不合適那么所用的循環(huán)數(shù)就會小,即出現(xiàn)Ct值過?。环粗?,起始模板量濃度過低,Ct值會偏大。 PCR擴增效率與 CT 值也是成反比關(guān)系,擴增效率高則CT值小,擴增效率低則需要要用到的循環(huán)數(shù)增加所對應(yīng)的CT值也會偏高。另外,合理的引物設(shè)計,防污染試劑的應(yīng)用也會影響到CT值的大小。

二、 有擴增曲線,但卻沒有CT,CT顯示狀態(tài)為Undetermined

這種情況下你通常也會發(fā)現(xiàn)由于閥值位置不正常正常導(dǎo)致熒光閾值線與擴增曲線沒有交點,所以儀器顯示狀態(tài)為Undetermined。出現(xiàn)這種如果擴增模板濃度是正常的,那么多數(shù)原因可能是由于系統(tǒng)界面參數(shù)設(shè)置錯誤所導(dǎo)致的。如果參與擴增的模板并非所有的孔,而系統(tǒng)界面在所有的  C-H行)都默認 設(shè)上了target sample 參與CT值計算。這個時候系統(tǒng)會默認所有孔參與熒光定量 PCR 實驗 。導(dǎo)致CT值錯誤。如果我們把無樣品C-H  數(shù)的targetsample 前面的√" 清除 重新分析計算,就會得到正常的熒光閾值線 C T 值了。

三、 有擴增曲線,閾值線的位置也正常,但大多數(shù)孔仍然不顯示CT值。

當(dāng)系統(tǒng)界面C-H 顯示出現(xiàn)異常提示(比如黃色三角形標(biāo)示),在數(shù)據(jù)分析中會再很多孔內(nèi)出現(xiàn) BLFAIL提醒。這表明基線分析失敗,如果確定我們在反應(yīng)物中加了熒光染料,如果加了,那么這種 熒光值偏低現(xiàn)象,可能由于使用了透光性不好PCR 耗材或不配套的耗材所導(dǎo)致。這種情況較容易出現(xiàn)在底部或側(cè)邊掃描檢測的PCR 儀器中;朗基的 Q2000系列采用的頂部CCD 實時檢測技術(shù)甚至可以用*不透明的白管進行實驗,所以一般不會存在這種問題。

四、 還有一種情況較為見也就是擴增曲線不正常,CT值都顯示“Undetermined"。 

此時,如果在熒光定量PCR檢測報告頁面出現(xiàn)了ROX的熒光值 0的情況,很可能是使用了不含ROX 試劑而系統(tǒng)參數(shù)中未做修改所造成,及時在分析設(shè)置中將 Passive reference dye的ROX 改成None,再重新分析即可正常顯示。有些沒有ROX 校正的PCR 儀中也較容易出現(xiàn)此類問題。 

從上面Qpcr實驗中常幾種常遇到的幾種情況中可以看出要想獲得 準確的pcr實驗結(jié)果,實驗的設(shè)計及樣本、配套試劑耗材、儀器類型的選擇、正確的軟件操作等都與實驗本身密不可分。

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