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Transwell實(shí)驗(yàn)的步驟

 更新時(shí)間:2023-03-02 點(diǎn)擊量:1643

    本文主要介紹 4種 Transwell實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟,具體包括:Transwell 腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell 上皮細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、Transwell B16 細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)、Transwell內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1遷移實(shí)驗(yàn)。
一、Transwell腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
過(guò)程與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)基本一致,不同的只是不需要鋪Matrigel。由于沒(méi)有基質(zhì)膠的阻擋,細(xì)胞穿過(guò)膜的速度較侵襲實(shí)驗(yàn)明顯加快,所以細(xì)胞量要更大。我做侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞密度是1×10°,而遷移實(shí)驗(yàn)的密度是1×10°。另外,下層培養(yǎng)液的FBS濃度也可適當(dāng)下調(diào),侵襲實(shí)驗(yàn)的濃度是5%,遷移實(shí)驗(yàn)的濃度是2.5%。
二、Transwell上皮細(xì)胞培養(yǎng)
1.將雄性 wistar大鼠麻醉,開(kāi)胸,將氣管取出,置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV、100 U/mL青霉素和100ug/mL鏈霉素、無(wú)Ca2t、無(wú)Mg2t、無(wú)血清的MEM。
2.用無(wú)菌的細(xì)胞刮棒刮氣管內(nèi)壁,將所得溶液離心后得到游離細(xì)胞。
 
3.離心后立即用新鮮的上述 MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的LHC-8 medium 沖洗一次。
4.沖洗過(guò)后,將得到的細(xì)胞懸液用臺(tái)盼蘭測(cè)定活力,若存活率大于 90%,則將細(xì)胞以10°/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾膜上(12mm),以37°C,5%CO2-95%空氣,含5%胎牛血清,100 U/mL青霉素,100μg/mL鏈霉素的LHC-8medium 孵育6~10天。
5. 孵育后,經(jīng)測(cè)定跨上皮電阻在1000-2000Q之間,即可用于電生理試驗(yàn)。顯微鏡下氣管上皮細(xì)胞形細(xì)胞呈鋪路石狀,圓形核位于中央,生長(zhǎng)時(shí)常彼此緊密連接成單層細(xì)胞片。
三、Transwell B16細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn)
把 Transwell 倒置,在 Transwell 的 PVPF 膜(0.8μm)的下表面涂一層fibronectin(10 μg/mL,50μL),37 度 2小時(shí),PBS 洗一遍后,放入預(yù)先每孔加有600μL的培養(yǎng)基(含10%血清)的24孔板內(nèi),后在Transwell的內(nèi)室加入細(xì)胞(100μL,用含0.1%血清的培養(yǎng)基稀釋好自己所需密度),放入培養(yǎng)箱,12-18小時(shí)后,取出Transwell,用棉簽擦去PVPF膜靠近內(nèi)室那一面的細(xì)胞,另一面的細(xì)胞用甲醛室溫固定30分鐘,結(jié)晶紫染色20分鐘,用清水洗3遍以上,后在顯微鏡下觀察細(xì)胞,記數(shù)。
 
四、內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1遷移實(shí)驗(yàn)
    1%明膠處理的Transwell經(jīng)無(wú)血清的MCDB131培液于培養(yǎng)箱中平衡1小時(shí)后上室加入 100μL 用serum-free MCDB131稀釋的5×104/孔的HMEC及不同濃度的藥物,下室加入0.6mL serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激遷移同時(shí)設(shè)置相應(yīng)陰性及陽(yáng)性對(duì)照,置于COa培養(yǎng)箱中作用8小時(shí),然后棄去孔中培液,用90%酒精常溫固定30分鐘,0.1%結(jié)晶紫常溫染色10分鐘,清水漂凈,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞,顯微鏡下觀察并拍照,最后用10%乙酸100μL/孔抽提10分鐘,于600nm處測(cè)定OD值。抑制率計(jì)算公式為:抑制率(%)=【(OD 值給藥組-OD值無(wú)刺激陰性對(duì)照)/(OD值不加藥陽(yáng)性對(duì)照-OD值無(wú)刺激陰性對(duì)照)×100%。
     蘇州阿爾法生物提供的腫瘤細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、干細(xì)胞等生物試劑用于腫瘤研究、新藥開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域。
 


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