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SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗步驟

 更新時間:2023-06-13 點擊量:2954

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理:

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS(十二烷基硫酸鈉), SDS會與變性的多肽,并使蛋白帶負(fù)電荷,由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān),因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān),在達到飽和的狀態(tài)下,每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。

當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時,蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW為分子量,X為遷移率,k、b均為常數(shù),若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖,可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳,根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳常用試劑及設(shè)備

試劑:蛋白值樣品,SDS-PAGE loading buffer,PBS,Tris-Hcl (PH 8.8), Tris-Hcl (PH 6.8) ,30%丙烯酰胺,10%SDS,10%過硫酸,5×SDS-PAGE電泳緩沖液,考馬斯亮藍R-250染色液,脫色液、天能預(yù)制膠。

儀器耗材:垂直電泳槽,電泳儀,電泳儀電源,移液槍,移液槍tip吸頭,離心管、試劑瓶。


實驗步驟

一、凝膠配置

1.分離膠的配制



電泳槽


(1)找出配套的膠板,用擦鏡紙擦干凈,并固定在配膠器上。隨后用去離子水試漏;

(2)若膠板不漏水,就進行分離膠的配制。依次將水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl(PH 8.8)、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中,混勻(1mm的膠板,一般配一塊膠用5ml。所配的膠濃度一般為12%,但濃度也要視情況而定。蛋白越小,膠的濃度越大);

(3)將膠板中的水倒掉,并用濾紙吸干水分(不要將濾紙塞到膠板底部);

(4)小燒杯中再加入TEMED,混勻。(TEMED可使膠凝固,所以最后加);

(5)灌膠:混勻的分離膠沿著膠板邊緣輕輕灌下,防止產(chǎn)生氣泡;

(6)用水將分離膠壓平(用水灌滿,同時加水時要緩慢加入,防止把膠吹起)。

也可以直接使用預(yù)制膠,預(yù)制膠直接拆開即用,不用配制。

2.濃縮膠的配制



SDS-PAGE



(1)待分離膠與水中間形成明顯的橫線,即分離膠凝固。隨后進行濃縮膠的配制,依次將水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl(PH 6.8)、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中;

(2)將分離膠上層的水倒掉,并用濾紙吸干水分(盡量不要把濾紙插入);

(3)小燒杯中再加入TEMED,混勻;

(4)灌膠。然后插入梳子;

(5)把制膠器倒過來,膠仍然不會往外流,或可以明顯看出梳子中兩個齒之間的膠面明顯凹下去,說明濃縮膠凝固。將凝固的膠板裝入電泳槽內(nèi),并在電泳槽內(nèi)加入SDS-PAGE電泳緩沖液,把膠浸泡一段時間,時間越長越好(防止梳子與膠相連,或膠因濕度不夠而縮減);

(6)點樣時,再把梳子拔出來,拔時動作要輕,防止膠齒被拔斷。

二、SDS-PAGE電泳步驟


1、調(diào)膠:拔掉SDS膠上的梳子,并用小針調(diào)整齒的位置(使它們都平行)。

2、點樣:用20µL的小槍頭,吸煮過的樣品10µL,對準(zhǔn)膠孔點樣,注意不要把樣品點在外面。使用適當(dāng)?shù)姆肿恿康鞍譵arker。

3、電泳:電泳儀正負(fù)極接好,打開電源。濃縮膠:電壓 low 100V,分離膠:電壓 high 150V。

4、卸膠:等膠內(nèi)的所有的藍色都跑出去,電泳停止,一般時間為1-2小時左右。把膠板從電泳儀上卸下,用刀片把膠板撬開,膠的濃縮膠部分割除;

5、染色:放入考馬斯亮藍R-250染色液中進行常溫過夜染色;

5、脫色:將過夜染色的SDS-PAGE膠放入脫色液中進行脫色,直到背景發(fā)白。

   蘇州阿爾法生物是一家集生命科學(xué)儀器設(shè)備、實驗耗材和實驗試劑供應(yīng)于一身的專業(yè)公司。阿爾法生物產(chǎn)品覆蓋生命科學(xué)研究、生物制藥、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域,包括的實驗室儀器設(shè)備有生物顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、蛋白電泳系統(tǒng)、數(shù)字PCR儀、高通量分析儀、高速冷凍離心機、超速離心機、臺式高速離心機、低速離心機、落地式離心機、迷你離心機、真空濃縮儀、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、生物反應(yīng)器、細(xì)菌培養(yǎng)箱研磨儀等,實驗耗材常用的nest培養(yǎng)瓶、rainin移液槍tip頭、離心管、PCR管、8聯(lián)排管、三角搖瓶、培養(yǎng)皿等,實驗試劑包括天根試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、蛋白抗體、碧云天試劑、阿拉丁試劑、腫瘤細(xì)胞株、基因編輯細(xì)胞、支原體清除試劑盒等。阿爾法生物一直與國際生命科學(xué)儀器廠商以及一些新興科技公司保持著深度的合作關(guān)系,這也為產(chǎn)品供應(yīng)和技術(shù)支持提供了有力保障。 作為十四年年專注于實驗室儀器設(shè)備、實驗耗材和實驗試劑供應(yīng)商,無論是實驗室的常規(guī)使用,還是科研人員的前沿探索,阿爾法生物都能夠為您提供良好的軟硬件支持和快捷、周到的服務(wù)。


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