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CRISPR-Cas9技術(shù)介紹

 更新時間:2023-07-26 點(diǎn)擊量:1362

 在過去的幾十年中,科學(xué)家們對基因編輯和基因修復(fù)技術(shù)進(jìn)行了大量的研究與實(shí)驗(yàn)。這些技術(shù)的發(fā)展為人類帶來了巨大的進(jìn)步,使得我們能夠更好地理解基因組的功能和調(diào)控,以及開發(fā)新的醫(yī)學(xué)研究方法。而其中一項(xiàng)成為重要和引人關(guān)注的技術(shù)就是CRISPR-Cas9。

CRISPR-Cas9是一種革命性的基因編輯工具,能夠通過精準(zhǔn)地剪切DNA序列來實(shí)現(xiàn)基因編輯和修復(fù)。CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 是一種存在于細(xì)菌和古菌中的天然防御機(jī)制,用于識別和摧毀入侵者的DNA。Cas9 (CRISPR associated protein 9) 是CRISPR 系統(tǒng)中的核酸酶,負(fù)責(zé)剪切DNA。結(jié)合CRISPR和Cas9,科學(xué)家們成功地將這一機(jī)制應(yīng)用于基因編輯和修復(fù)領(lǐng)域。

CRISPR基因敲除試劑盒

  CRISPR-Cas9技術(shù)的工作原理非常簡單??茖W(xué)家們開始設(shè)計(jì)并合成一小段RNA引導(dǎo)序列,該序列能夠與目標(biāo)基因的特定序列配對。然后,將這段 RNA引導(dǎo)序列與Cas9蛋白結(jié)合,形成可以識別和剪切DNA的復(fù)合物。一旦復(fù)合物與目標(biāo) DNA配對,Cas9蛋白就會剪切目標(biāo)基因的DNA鏈,從而引發(fā)一系列的修復(fù)過程。

  CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用范圍比較廣泛。它可以用于研究基因功能和調(diào)控機(jī)制。通過定點(diǎn)編輯 DNA 序列,科學(xué)家們可以觀察和分析基因在細(xì)胞或生物體中的功能變化。這種精確操縱基因的能力,使得科學(xué)家們能夠更好地理解生物體的發(fā)育、疾患發(fā)生機(jī)制以及藥物開發(fā)。

   除了研究應(yīng)用外,CRISPR-Cas9還具有潛力在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域進(jìn)行基因改良。科學(xué)家們利用CRISPR-Cas9技術(shù),可以快速、精確地在作物基因組中引入有益特質(zhì),如提高產(chǎn)量、抗蟲和抗逆性。這種基因編輯的方法,相較于傳統(tǒng)基因改良,具有更高的效率和更短的時間。

實(shí)驗(yàn)案例:

在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中,科學(xué)家們使用CRISPR-Cas9技術(shù)成功地修復(fù)了人類β-地中海貧血病變體。他們通過剪切和修復(fù)患者的異常基因,在細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因修復(fù)。此次實(shí)驗(yàn)的成功證明了 CRISPR-Cas9技術(shù)在基因醫(yī)學(xué)研究中的潛力,開創(chuàng)了醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域新高

    然而,盡管CRISPR-Cas9技術(shù)具有巨大的潛力和許多應(yīng)用前景,但它也面臨一些挑戰(zhàn)。但是挑戰(zhàn)之一是確保編輯的準(zhǔn)確性和安全性,以避免不可預(yù)見的副作用和后果。此外,倫理和法律問題也需要認(rèn)真考慮和解決,以確保技術(shù)的適當(dāng)應(yīng)用。


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  Cas9-Cell line Knock-In service(Cas9-CKI)基因定點(diǎn)敲入細(xì)胞系是Cas9X技術(shù)團(tuán)隊(duì)針對實(shí)驗(yàn)室常用的各種細(xì)胞系,研究并確立針對不同的細(xì)胞的外源基因或者片段高效敲入(Knock-in, KI)的技術(shù)操作規(guī)程,主要目的就是:解決KI效率低下和KI片段長度限制的問題。



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 案例分析
  基因敲入項(xiàng)目名稱
  構(gòu)建eGFP基因敲入的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
種屬:Human; 基因名稱:PRNP
gRNA位點(diǎn):ATCTTCCTGATAGTGGGATGAGG 
Donor載體:5'arm-eGFP-3'arm

基因敲入技術(shù)原理圖
細(xì)胞信息
種屬:Human; 細(xì)胞名稱:人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251
培養(yǎng)基:DMEM,10%FBS 
  
細(xì)胞檢測
無菌檢測:合格; 支原體檢測:合格
細(xì)胞克隆形成率檢測:細(xì)胞增殖能力較好,克隆形成率較好。 
細(xì)胞基因型檢測:針對gRNA打靶位置及其附近基因組序列進(jìn)行測序。測序結(jié)果與理論序列一致。 
 
細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)                                                           
電轉(zhuǎn)參數(shù):1005V,35ms,2次; 電轉(zhuǎn)體系:10 uL
  
PCR 篩選
篩選克隆數(shù)量:160; 陽性數(shù)量:10


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