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SDS-PAGE 膠染色介紹

 更新時間:2023-11-23 點擊量:926

 

一、各種蛋白染色方法的靈敏度比較

 

染色.png

 

 

二、考馬斯亮藍染色

CBB 染色液

0.5%考馬斯亮藍 G250 或 R250

40%甲醇

10%乙酸

將 CBB 溶于甲醇中并不停的攪拌 15min。加入乙酸與 ddH2O 脫色液: 30%甲醇

10%乙酸

染色方法: 1.在搖床上染色 30min.

2.脫色至蛋白點或條帶清晰可見

3. ddH2O 洗 3-5 次

三、膠體考馬氏亮藍染 色 Colloidal Coomassie Staining( Cambridge centre for porteomics )

sensitivity = ~100ng

1.  固定:甲醇/醋酸/H2 O(45:1:54) 至少 20min.

2.  染色 12-18hr。

染色液:   17% (w/v)  硫酸銨

34%甲醇

0.5%醋酸

0.1% (w/v) Coomassie G250

3.  脫色:用 H2O 脫色至蛋白點和背景清晰.

雙向電泳蛋白點的切取和保存

1.   用 PDQuest 軟件或肉眼比對,找出感興趣的蛋白點,并做好標記和記錄。

2.   用 MilliQ  水沖洗膠 2 次。

3.   用色譜純甲醇和 MilliQ  水沖洗 Ep 管

4.   將槍頭(200µl)下端剪去,使其內徑略小于蛋白斑點的直徑,用色譜純甲醇和 MilliQ 水沖洗槍頭。

5.   對準斑點中央小心將蛋白切割下來, 放入 Ep 管,MilliQ 水漂洗 2 次, 如膠塊 太大,將其切成 1 x 1 mm 的膠片。

6.   將切好的點做好標記和記錄,置-80oC 保存或凍干后-20oC 存放。

注意事項:

1.   盡量避免皮膚和頭發(fā)的角蛋白的污染,在操作過程中應戴一次性的 PE 手套 (不用乳膠手套)和帽子。

2.   不要將膠長期存放于乙酸溶液中。

3.   Ep 管及染膠的容器必須用甲醇和水充分清洗, 尤其應與進行 Western blotting 的容器分開,以避免 casein 或 BSA 的污染。

 

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