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測序儀和PCR儀有什么不同?

 更新時間:2024-09-02 點擊量:725

 測序儀和PCR儀是現(xiàn)代分子生物學實驗中重要的實驗室儀器,它們在基因研究和核酸檢測等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。雖然兩者都與 DNA相關(guān),但它們的功能和原理卻大相徑庭。測序儀和PCR有什么不同?

一、工作原理

1. PCR儀(聚合酶鏈式反應儀)工作原理

PCR儀的主要功能是進行聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR),這是一種在體外模擬DNA自然復制的過程。PCR儀通過控制溫度變化,使DNA樣本在以下幾個階段循環(huán):

1)變性:將雙鏈DNA加熱至94-98℃,使DNA雙鏈分離成單鏈。

2)退火:將溫度降至50-65℃,使引物與單鏈DNA模板結(jié)合。

3)延伸:將溫度升至72℃,DNA聚合酶開始沿著引物方向合成新的DNA鏈。

通過這三個階段的循環(huán),PCR儀可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)DNA的指數(shù)級擴增。

2. 測序儀工作原理

目前常用的測序技術(shù)是Sanger測序和二代測序(Next-Generation Sequencing, NGS)。

基因測序

Sanger測序(第一代測序技術(shù))

  • Sanger測序是一種鏈終止法,其基本原理如下:

  • DNA模板準備:先需要將待測序的DNA片段克隆到適當?shù)妮d體中,并通過PCR擴增出大量的單鏈DNA模板。

  • 測序反應混合物的制備:將DNA模板與四種不同的脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、適量的DNA聚合酶和一種或多種帶有不同熒光標記的鏈終止核苷酸(ddNTPs)混合。

  • 鏈延伸與終止:在DNA聚合酶的作用下,DNA鏈會不斷地延伸。當鏈終止核苷酸(ddNTPs)被加入到正在延伸的DNA鏈中時,由于它沒有3’羥基,無法形成磷酸二酯鍵,導致DNA鏈的延伸在此處終止。

  • 電泳分離:將測序反應產(chǎn)物加載到毛細管電泳儀中,通過電泳根據(jù)片段長度進行分離。由于鏈終止核苷酸帶有不同的熒光標記,因此在電泳過程中會發(fā)出不同顏色的熒光。

  • 熒光檢測與數(shù)據(jù)分析:電泳過程中,熒光檢測器會記錄下熒光信號,并生成測序峰圖。通過分析峰圖,可以確定DNA序列。


  • 二代測序儀

二代測序(NGS

二代測序技術(shù)包括多種不同的平臺,如Illumina/SolexaRoche/454、Ion Torrent等,它們的工作原理各有不同,但基本步驟相似。以下以Illumina/Solexa平臺為例解釋其工作原理:

  • 文庫構(gòu)建:將待測序的DNARNA片段化,并在片段兩端添加特定的適配器( adapters ),通過 PCR 擴增形成測序文庫。

  • 測序芯片加載:將測序文庫加載到測序芯片上,每個芯片上有數(shù)百萬到數(shù)十億個獨立的測序反應微孔。

  • 橋式PCR擴增:在微孔中,通過橋式PCR擴增,使每個微孔中只含有一個特定的 DNA片段的多個拷貝。

  • 測序循環(huán):測序循環(huán)包括以下幾個步驟:

  • 加堿基:向微孔中加入四種不同的熒光標記的核苷酸,但它們不含有鏈終止基團。

  • 成像:檢測并記錄每個微孔中的熒光信號,對應于加入的核苷酸。

  • 化學降解:去除未結(jié)合的核苷酸和熒光標記,為下一輪測序循環(huán)做準備。

  • 數(shù)據(jù)分析:通過分析每個循環(huán)的熒光信號,生成原始測序數(shù)據(jù)。然后,通過生物信息學分析,將這些數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成DNA序列。

  • 二代測序技術(shù)因其高通量、高效率、低成本的特點,在基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、表觀遺傳學等領(lǐng)域得到了廣泛應用。

    二代測序原理1


    二、PCR儀和測序儀的應用領(lǐng)域

    1. PCR

    PCR儀廣泛應用于以下領(lǐng)域:

    1)基因克?。和ㄟ^PCR擴增目的基因片段,用于后續(xù)的基因克隆、突變等實驗。

    2)核酸檢測:用于病原體檢測、遺傳病診斷、法醫(yī)學鑒定等。

    3)基因表達分析:通過實時熒光定量PCRqPCR)技術(shù),研究基因表達水平。

    2. 測序儀

    測序儀應用于以下領(lǐng)域:

    1)基因組學研究:如人類基因組計劃、動植物基因組測序等。

    2)疾病研究:通過全外顯子組測序、全基因組測序等技術(shù),研究遺傳性疾病、腫瘤等疾病的發(fā)病機制。

    3)微生物研究:對微生物群落進行多樣性分析,揭示微生物與環(huán)境的相互關(guān)系。


    PCR

    PCR和測序儀雖然都與DNA相關(guān),但它們的工作原理和應用領(lǐng)域有很大差異。簡而言之,PCR儀主要用于DNA的擴增,而測序儀則用于測定DNA序列。

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