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使用G418篩選HEK-293T細(xì)胞的詳細(xì)步驟

 更新時(shí)間:2025-02-08 點(diǎn)擊量:397

使用G418篩選HEK-293T細(xì)胞的詳細(xì)步驟

1. 細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇HEK-293T細(xì)胞,用合適的培養(yǎng)基(如DMEM高糖培養(yǎng)基,含 10%胎牛血清等)在37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度達(dá)80%-90% 時(shí)進(jìn)行傳代或轉(zhuǎn)染操作。

2. 確定G418篩選濃度:如客戶所做,在96孔板中接種細(xì)胞,設(shè)置 0 - 1100 μg/mL的G418濃度梯度,用CCK8 檢測培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞活性,繪制細(xì)胞活力圖,確定HEK-293T細(xì)胞的G418 最小致死量。

3. 轉(zhuǎn)染:將目的基因連接到pCDNA3.1載體上,使用合適的轉(zhuǎn)染試劑(如Lipofectamine 3000 ),按照試劑說明書將重組載體轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染6小時(shí)后換液。

4. 加藥篩選:轉(zhuǎn)染后1 - 2天,根據(jù)確定的最小致死量,加入適量G418進(jìn)行篩選??梢韵炔捎幂^低濃度篩選一輪,比如最小致死量的 1/2 - 2/3濃度,維持篩選2 - 3周,期間每2 - 3天換液并補(bǔ)充G418 。然后再用較高濃度(接近或等于最小致死量)進(jìn)行第二輪篩選1 - 2周。

5. 單克隆挑選:待細(xì)胞形成單克隆后,用有限稀釋法或細(xì)胞克隆環(huán)將單克隆細(xì)胞挑選到96孔板中繼續(xù)培養(yǎng),擴(kuò)大培養(yǎng)后檢測目的基因的表達(dá)情況。

G418流程圖

HEK-293T細(xì)胞篩選注意事項(xiàng)

1. 細(xì)胞狀態(tài):確保用于轉(zhuǎn)染和篩選的HEK-293T細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài),細(xì)胞活力應(yīng)在90% 以上,且無支原體等污染。

2. 轉(zhuǎn)染效率:優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,包括轉(zhuǎn)染試劑與DNA的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間等,以提高轉(zhuǎn)染效率??稍O(shè)置不同轉(zhuǎn)染條件的對(duì)照組,確定優(yōu)良轉(zhuǎn)染方案。

3. G418質(zhì)量:G418的質(zhì)量對(duì)篩選結(jié)果影響較大,應(yīng)選擇質(zhì)量可靠的產(chǎn)品,使用前檢查其效價(jià)和純度,溶解后過濾除菌,-20 ℃保存。

4. 篩選濃度:篩選濃度需根據(jù)細(xì)胞活力圖結(jié)果和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)確定,濃度過低可能導(dǎo)致假陽性細(xì)胞過多,過高則可能殺死陽性細(xì)胞。

5. 換液頻率:篩選期間換液頻率不宜過高或過低,過高可能導(dǎo)致細(xì)胞生長受影響,過低可能使代謝廢物積累影響細(xì)胞狀態(tài)和篩選效果。

6. 無菌操作:整個(gè)篩選過程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范,防止雜菌污染。

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