技術(shù)文章
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2023-215
DNA重組技術(shù),是分子的生物學研究生需要掌握的實驗技術(shù)之一,DNA重組實驗方法總結(jié)如下:一、實驗?zāi)康捏w外連接獲得重組分子,用于轉(zhuǎn)化受體細胞。二、實驗原理DNA重組技術(shù)是用內(nèi)切酶分別將載體和外源DNA切開,經(jīng)分離純化后,用連接酶將其連接,構(gòu)成新的DNA分子。外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種:1、帶有非互補突出端的片段用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進行消化可以產(chǎn)生帶有非互補的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA片段,一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組...
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2023-215
PCR儀使用參數(shù)設(shè)定注意事項PCR儀使用參數(shù)設(shè)定不正確會影響到PCR實驗結(jié)果,這主要表現(xiàn)在溫度、時間和循環(huán)次數(shù)上,如果溫度參數(shù)設(shè)置過高,延伸時間不夠都會對實驗結(jié)果造成影響,下面談?wù)勈褂肞CR儀參數(shù)設(shè)定時的注意事項:一、溫度和時間溫度與時間的設(shè)置:基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40~60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物鏈沿模...
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2023-215
丙酮酸羧化酶是細胞質(zhì)和線粒體代謝途徑的重要元素,可以有效促進能量代謝。在CHO細胞中過表達酵母胞質(zhì)丙酮酸羧化酶(PYC2),可以增加丙酮酸流向TCA循環(huán)。增強的PYC2表達導(dǎo)致丙酮酸通量增加,從而使乳酸積累減少多達4倍,并顯著增加細胞密度和培養(yǎng)壽命。有了這個結(jié)果,與親本細胞相比,工程細胞的抗體表達顯著提高了70%,產(chǎn)品質(zhì)量也有所提高(約3倍)。通過PYC2工程改造提升細胞性能,在丙酮酸、葡萄糖、乳酸和細胞能量代謝方面具有均高于親代細胞的各種優(yōu)勢。PYC2工程改造原理和方法在補...
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2023-214
A載體和外源DNA的酶切一、實驗?zāi)康膶W習和掌握核酸的酶切操作原理;通過酶切獲得可進行體外重組的載體和外源DNA。二、實驗原理限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'...
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2023-214
質(zhì)粒DNA的提取實驗方法和步驟一、實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學習和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和步驟。二、實驗原理從細菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟:培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增;收集和裂解細胞:分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和TritonX-100可使細胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或TritonX-100處理后,細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上,同時由于細菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性...
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